Dhia Shanan Al-Hissnawy,Salman Azez Al-Jibouri,Azhar Ammran AL-Thahab†
Trừu tượng
Nghiên cứu này bao gồm việc điều tra khả năng của Citrobacter freundii. Để tạo ra enterotoxin không bền nhiệt theo cả kiểu gen và kiểu hình. Chỉ có 11 mẫu phân lập được phân lập từ 422 mẫu lâm sàng (282 mẫu phân và 140 mẫu nước tiểu). 8 mẫu phân lập từ mẫu phân và 3 mẫu từ mẫu nước tiểu. Tất cả các phân lập được xác định bằng các xét nghiệm sinh hóa. Và được xác nhận bằng API 20 E. Phát hiện phân tử cho gen chịu trách nhiệm về các gen enterotoxin (lt, ltI-h và ltA) đã đạt được bằng kỹ thuật PCR. Kết quả cho thấy ltA là gen enterotoxin không bền trong 5 phân lập (45,45%). Thử nghiệm vòng lặp ileal ligated thỏ RIL, được áp dụng cho 11 Isolates. Chỉ có 4 phân lập vi khuẩn cho kết quả dương tính.
Giới thiệu
Citrobacter freundii thường được coi là một loài hồi sinh của ruột người, mặc dù một số chủng đã thu được các đặc điểm độc lực cụ thể cho phép chúng gây ra tiêu chảy. Do đó, các yếu tố độc lực tương đồng, và một số thậm chí giống hệt như các yếu tố được mô tả trong các kiểu bệnh E.coli đã được phát hiện trong các chủng Citrobacter freundii phân lập từ các trường hợp tiêu chảy lẻ tẻ ở trẻ sơ sinh [10, 12].
Tại địa phương, Citrobacter freundii phân lập từ các mẫu khác nhau bao gồm phân, gạc trực tràng, nước tiểu, máu, đờm, dịch não tủy, vết thương, tai, mũi và họng ở thành phố Baghdad và Hilla [2, 3] Gen LT được sao chép vào E. coli và hai protein của phân tử C Đánh giá Citrobacter freundii như một nhà sản xuất Enterotoxin nhiệt (LT) Dhia Shanan Al-Hissnawy Salman Azez Al-Jibouri * Azhar Ammran AL-Thahab Đại học Nha khoa, Kufa * Đại học Y, Đại học Kufa, Najaf, Iraq.
Đại học Khoa học, Đại học Babylon, Hilla, Iraq. M J B Tạp chí y tế của Babylon-Vol. 9- Số 1 -2012 ???? ???? ?????? – ?????? ?????? – ????? ????? – 1021 Dhia Shanan Al-Hissnawy, Salman Azez Al-Jibouri và Azhar Ammran AL-Thahab 2 có trọng lượng 11,500 (tiểu đơn vị B) và 25.500 (tiểu đơn vị) được sản xuất [5]. Các gen cấu trúc tiểu đơn vị LT (eltA) đã được giải trình tự và trình tự axit amin được suy ra.
Trọng lượng phân tử tính toán của LT A là 29,673Da:
Các gen tiểu đơn vị A của CT và LT (LT-I) là 78,6% tương đồng và các gen của tiểu đơn vị B là tương đồng 78% [16]. Các gen của LT-IIa đã được nghiên cứu. Nó được tổ chức theo một đơn vị phiên mã tương tự như của CT và LT-I. Gen A của tiểu đơn vị LT-IIa được tìm thấy tương đồng 57% với gen A của tiểu đơn vị. LTh-I và 55% tương đồng với gen A của CT. Hầu hết các tương đồng có nguồn gốc từ khu vực của gen A mã hóa đoạn A1. Gen B của LTIIa không tương đồng với gen B của LTh-I hoặc CT [13].
Nguyên liệu và phương pháp
Xử lý và xác định Citrobacter freundii:
Trong khoảng thời gian từ tháng 7 năm 2010 đến tháng 10 năm 2010. Tổng số 422 mẫu lâm sàng (282 phân và 140urine) đã được lấy từ các bệnh nhân nghi ngờ bị tiêu chảy và nhiễm trùng đường tiết niệu, 50 người khỏe mạnh (đối chứng). Mẫu được thu thập từ ba bệnh viện ở Najaf (Al-Sadr Dạy, Al-Hakeem, và Sản phụ và Trẻ em Al-Zahra). Xác định các chủng vi khuẩn được xác định ở cấp độ loài bằng các xét nghiệm hình thái và sinh hóa truyền thống [11].
Tất cả các phân lập được xác nhận nhận dạng với hệ thống API 20 E. Các phân lập vi khuẩn được bảo quản trên môi trường thạch dinh dưỡng ở 4 ° C. Các phân lập được duy trì hàng tháng trong suốt quá trình nghiên cứu bằng cách nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy mới.
Để bảo quản lâu, nước dùng dinh dưỡng bổ sung 15% glycerol đã được sử dụng và các chủng được duy trì đông lạnh (-20? C) trong thời gian dài trong vài tháng [4] Các thử nghiệm phản ứng chuỗi polymerase được thực hiện trong thể tích phản ứng 25 l và các điều kiện khuếch đại PCR được thực hiện với một chu trình nhiệt là đặc trưng cho từng bộ mồi đơn lẻ tùy thuộc vào quy trình tham chiếu của chúng, như sau :
Phản ứng chuỗi polymerase:
DNA được chiết xuất bằng phương pháp Salting out [14]. DNA (được chiết xuất từ tế bào vi khuẩn) đã được sử dụng làm mẫu trong các PCR cụ thể để phát hiện gen enterotoxin. Một cặp mồi cho mỗi gen được liệt kê trong bảng (1). Đã được sử dụng để khuếch đại một đoạn bao phủ toàn bộ gen. Một hỗn hợp phản ứng duy nhất chứa chiết xuất DNA 5, l 12,5 hỗn hợp Master (Master mix 2X Promega: Go Tag DNA polymerase được cung cấp trong 2 lần đệm Green Taq Reaction pH 8,5, 400?m DATP, DGTP, DCTP, DTTP, và 3mM MgCl2), 2? l 10 pmol /? l của các đoạn mồi ngược dòng cụ thể và, 2 l l 10 pmol / l.
Là các đoạn mồi hạ lưu cụ thể thể tích sau đó được hoàn thành đến 25? – nước miễn phí. Tất cả các bổ sung đã được thực hiện trong dòng chảy tầng trên.
Kết quả
Phát hiện phân tử của enterotoxin không bền của các chủng Citrobacter freundii:
DNA được chiết xuất từ tất cả các phân lập trong nghiên cứu này và được sử dụng làm khuôn mẫu cho các xét nghiệm PCR. Đối với các gen enterotoxin không bền nhiệt (lt, lt1-h và ltA). C. freundii giữ lại ltA như một gen enterotoxin bền nhiệt ở 5 phân lập (C1,2,3,6 và 10) với tỷ lệ phần trăm 45,45% (Hình 1).
Các gen enterotoxin không bền nhiệt khác cho thấy. Kết quả âm tính ít nhất là trong các chu trình nhiệt được liệt kê trong bảng (2). Lanes (C1, 2, 3, 6 và 10) cho thấy kết quả dương tính với gen ltA. ? Lanes (C4,5,7,8,9 và 11) cho thấy kết quả âm tính với gen ltA? Lane (L), đánh dấu kích thước phân tử DNA (thang 100 bp)
Sinh học enterotoxin không bền trong môi trường nhiệt:
Thử nghiệm vòng lặp ileal ligated thỏ RIL (Hình 2). Được áp dụng cho các chủng C. freundii phân lập được trong nghiên cứu này. Kết quả cho thấy chỉ có 4 phân lập vi khuẩn cho kết quả dương tính. (C1: 0,74, C2: 0,86 C3: 0,76 và C10: 0,76) ml / cm với tỷ lệ 36,36%. Trong khi các phân lập vi khuẩn khác. Kết quả âm tính so với độc tố dịch tả. Dưới dạng đối chứng dương (1,1 ml / cm) và (chiết xuất men TSB + 6%). Dưới dạng đối chứng âm (0,15 ml / cm) như trong bảng (3).
Thảo luận
Phát hiện phân tử đối với enterotoxin bền nhiệt của Citrobacter freundii phân lập:
Từ hình (1), C. freundii cho thấy kết quả dương tính với ltA (696bp). Khi các gen chịu trách nhiệm đối với enterotoxin chịu nhiệt bằng PCR. C. freundii được biết đến là nhà sản xuất enterotoxin. xác định và mô tả một gen mã hóa tương đồng của các tiểu đơn vị B của độc tố dịch tả (CTB) và enterotoxin bền nhiệt (LTB) của E. coli từ một chủng C. freundii phân lập lâm sàng được tìm thấy để tạo ra một yếu tố trong siêu mẫu nuôi cấy. phản ứng chéo với kháng thể với CTB và LTB khi được xét nghiệm bằng xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên quan đến enzyme (ELISA) [10].
Gen mã hóa yếu tố dương tính ELISA, cfxB, bao gồm:
375 nucleotide và nằm ở hạ lưu của khung đọc mở 852 nucleotide, cfxA, với không gian xen kẽ 56 nucleotide. Gen cfxB được dự đoán sẽ mã hóa một polypeptide 125-amino-acid. Các chủng C. freundii phân lập từ nước môi trường được xác định là các chủng enterotoxin sinh nhiệt (LT). Chịu nhiệt bằng phương pháp miễn dịch và khuếch đại chuỗi polymerase. Một mảnh khuếch đại 322 bp đã thu được [9].
Xét nghiệm sinh học Enterotoxin cho thấy trong bảng (3). Ghi nhận sự tích tụ chất lỏng rõ rệt chỉ trong 4 phân lập vi khuẩn. Kết quả dương tính (C1-3 và C10) ml / cm với tỷ lệ 36,36%. Trong xét nghiệm vòng lặp dây chằng thỏ là chỉ số về khả năng chịu nhiệt hoạt động enterotoxin.
Khả năng tất cả các chủng có khả năng tạo ra enterotoxin:
Chịu nhiệt với (100%) bằng cách kiểm tra tính thấm chậm của da thỏ và xét nghiệm phù chân chuột có tính đến sự khác biệt về mức độ độc tính giữa các chủng sản sinh độc tố này [1]. Strain phân lập từ nước tiểu và phân cho thấy kết quả âm tính với RIL [7]. Sinh khối enterotoxin có lợi thế hơn các hệ thống nuôi cấy tế bào chỉ phát hiện độc tính tế bào [17].
>>> Tham khảo thêm ở bản gốc: C.freundii
