Trừu tượng
Human rhinovirus (HRV) là vi sinh vật đường hô hấp phổ biến nhất, gây nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính đặc biệt ở trẻ nhỏ khỏe mạnh, người già và người bị suy giảm miễn dịch. Chẩn đoán nhiễm Human rhinovirus bằng phương tiện lâm sàng và thuận tiện phức tạp hơn do thiếu các công cụ nhạy cảm, chính xác để phân biệt Human rhinovirus với các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp khác. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một phương pháp phân tử PCR sao chép ngược thời gian thực nhanh chóng, cụ thể và nhạy cảm để phát hiện Human rhinovirus (HRV) từ các mẫu dịch tiết mũi họng.
Các Primers được thiết kế từ gen polyprotein được bảo tồn cao của virus rhovirus ở người. Kết quả của chúng tôi đã cho thấy xét nghiệm RT-PCR dương tính là cụ thể trong phát hiện HRV và quan sát thấy ở 41 trên 50 mẫu vật (82%).
Giới thiệu
Rhinovirus là một loại virus RNA đơn chuỗi thuộc họ picornavirus. Có hơn một trăm loại huyết thanh của rhovovirus tồn tại. Việc truyền virus bắt đầu thông qua một hạt aerosol hạt lớn, trước tiên ảnh hưởng đến biểu mô mũi bị muối. Sự xâm nhập của virus vào biểu mô mũi không trực tiếp, mà là gây ra phản ứng viêm cấp tính. Các chất trung gian gây viêm sau đó gây phù & tăng huyết áp của niêm mạc mũi kéo dài vào hầu họng [1]. Sự sao chép được giới hạn ở các tế bào của đường hô hấp trên với sự tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ thấp hơn khoảng 33 C?.
Vào những năm 1950, sự phân lập HRV
Được tìm thấy ở những bệnh nhân bị nhiễm trùng đường hô hấp trên [2, 3], và từ đó, HRV đã được biết đến như một loại virus cảm lạnh thông thường vì những virus này chịu trách nhiệm cho khoảng 50% đường hô hấp trên nhiễm trùng [4]. Thông thường, Human rhinovirus (HRV) liên quan đến nhiễm trùng đường hô hấp trên nhẹ và làm trầm trọng thêm bệnh hen suyễn ở trẻ em [5,6,7,8]. Ở những bệnh nhân suy giảm miễn dịch, hầu hết các bệnh nhiễm trùng do virus là đơn giản và tự giới hạn trong khi ở những bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch có khả năng bị biến chứng nghiêm trọng [9].
Trước đây, chẩn đoán HRV gặp nhiều khó khăn do nuôi cấy virus bị hạn chế [10], nhưng do những tiến bộ lớn trong khuếch đại axit nucleic và các phương tiện khác như sinh học phân tử, chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật PCR phiên mã ngược để phát hiện HRV và quyết định khi HRV là tác nhân gây bệnh và chịu trách nhiệm [11,12,13,14].
Nguyên liệu và phương pháp
Thu thập mẫu bệnh phẩm
Năm mươi mẫu dịch tiết mũi họng được thu thập từ các bệnh nhân trưởng thành bị nhiễm trùng đường hô hấp trên cấp tính từ Bệnh viện giảng dạy Al-Diwanyia. Các mẫu được đặt trong bình chứa 25ml vô trùng và được vận chuyển trực tiếp vào phòng thí nghiệm và được bảo quản trong tủ đông cho đến khi được sử dụng trong chiết xuất RNA của virus.
Chiết xuất RNA virus
Việc chiết RNA virus từ các mẫu dịch tiết mũi họng bằng cách sử dụng (Bộ chiết tách RNA của AccuZolTM Bione. Korea). Một mẫu 250 mũi họng được đặt trong ống siêu nhỏ 1,5 ml, và sau đó thuốc thử trizol 1m được thêm vào và trộn đều bởi xoáy trong một phút. Sau đó, 200 chlorlorm đã được thêm vào và trộn mạnh trong 15 giây, và sau đó các nội dung đã được ủ trong 5 phút trên băng. Các ống được đặt trong máy ly tâm lạnh 4 ° C ở 12000 vòng / phút trong 15 phút. Chúng tôi đã chuyển phần nổi phía trên sang một ống siêu nhỏ mới, sau đó thêm 500 lượng isopropanol và nội dung được trộn bằng cách đảo ngược ống 4 đến 5 lần và được ủ ở 4 ° C trong 10 phút.
Các ống quay trở lại máy ly tâm ở tốc độ 12000 vòng / phút trong 10 phút, và sau đó phần nổi phía trên đã bị loại bỏ. Các viên RNA được rửa bằng cách thêm 1 ml 80% Ethanol với DEPC và trộn lại, sau đó, đặt vào máy ly tâm ở tốc độ 12000 vòng / phút trong 5 phút. Sau đó, phần nổi phía trên đã loại bỏ và các viên RNA tiếp xúc với không khí để làm khô. Cuối cùng, 50 nước DEPC được thêm vào để rửa giải RNA, sau đó mẫu RNA được chiết xuất được kiểm tra bằng máy đo quang phổ Nanodrop và được bảo quản trong tủ đông -20 ° C cho đến khi được sử dụng trong xét nghiệm RT-PCR.
PCR sao chép ngược
RT-PCR được thực hiện bằng cách sử dụng bộ RT-PCR một bước (AccuPower® RT-PCR PreMix từ Bione. Korea). Các mồi RT-PCR được thiết kế trong nghiên cứu này là từ chủng Human Rhinovirus loại 14 (HRV14) (NCBI-Genbank: K02121.1) dành riêng cho khuếch đại gen protease HRV, mồi trước (GGTGGCATGCCCTCAGGGTG) ). Các mồi được cung cấp từ Công ty tiên phong. Hàn Quốc).
Các kết quả
PCR sao chép ngược đã xuất hiện dưới dạng xét nghiệm đặc biệt và có độ nhạy cao, có thể được sử dụng để phát hiện Human rhinovirus từ dịch tiết mũi họng của mẫu bệnh nhân nhiễm trùng đường hô hấp trên. Kết quả xét nghiệm RT-PCR cho thấy 41 mẫu dương tính trong số 50 mẫu (82%).
Xét nghiệm RT-PCR
Được sử dụng trong khuếch đại gen protease HRV từ các mẫu chiết RNA trong một bước sao chép ngược RNA của virus thành cDNA và sau đó khuếch đại PCR ở một phản ứng ống xuất hiện dưới dạng phát hiện cụ thể của HRV (Hình 1).
Khả năng phát hiện HRV
trong các mẫu dịch tiết mũi họng đã tăng lên nhiều lần khi sử dụng xét nghiệm RT-PCR được kiểm chứng. Trong nghiên cứu này, đã phát hiện thường xuyên virus rhovirus ở người bằng RT-PCR, những kết quả này phù hợp với Xiang ZD [15] đã giải thích rằng hệ thống RT-PCR một bước rất đặc hiệu, nhanh chóng và thuận tiện cho việc phát hiện RNA HRV trong dịch tiết mũi họng của bệnh nhân bị nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính và bộ gen của virus HRV rất khác nhau. Tuy nhiên, các quy trình chẩn đoán tê giác ở người sử dụng nuôi cấy mô bị giới hạn bởi chuyên môn của phòng thí nghiệm chẩn đoán và thời gian cần thiết để đạt được kết quả như vậy, nuôi cấy virus có một vị trí hạn chế trong vi sinh chẩn đoán thông thường [16].
Human rhinovirus (HRV)
Là nguyên nhân chính gây ra các triệu chứng cảm lạnh thông thường ở người lớn và trẻ em, bệnh nhân trưởng thành cũng thường xuyên bị nhiễm trùng đường hô hấp trên do nhiễm Human rhinovirus [17]. Hơn một trăm loại huyết thanh của loài tê giác người (HRV), là thành viên của họ Picornaviridae, được xác định thông qua giám sát của cộng đồng đối với bệnh cảm lạnh thông thường về hô hấp [18]. Human rhinovirus (HRV) là mầm bệnh đường hô hấp phổ biến nhất, gây ra không chỉ nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính và viêm phổi mắc phải ở cộng đồng ở trẻ em, mà còn gây ra bệnh hen suyễn và suy thoái [15].
Sự vắng mặt của phương pháp phát hiện làm hạn chế sự hiểu biết lâm sàng về khả năng gây bệnh của HRV và gây ra việc sử dụng kháng sinh không hợp lý bằng các xét nghiệm huyết thanh học.
Nghiên cứu của chúng tôi nhằm xây dựng một hệ thống PCR sao chép ngược (RT) một bước để phát hiện cụ thể RNA của Human rhinovirus. Do đó, chúng tôi kết luận rằng hệ thống RT-PCR một bước có thể được coi là đặc hiệu cao, nhanh chóng và thuận tiện để phát hiện HRV trong dịch tiết mũi họng của bệnh nhân bị nhiễm trùng đường hô hấp trên và phương pháp chẩn đoán phân tử có thể phù hợp với quy mô lớn nghiên cứu lâm sàng và dịch tễ học.
Thảo luận
PCR sao chép ngược đã xuất hiện dưới dạng xét nghiệm đặc biệt và có độ nhạy cao, có thể được sử dụng để phát hiện Human rhinovirus từ dịch tiết mũi họng của mẫu bệnh nhân nhiễm trùng đường hô hấp trên. Kết quả xét nghiệm RT-PCR cho thấy 41 mẫu dương tính trong số 50 mẫu (82%). Xét nghiệm RT-PCR được sử dụng trong khuếch đại gen protease HRV từ các mẫu chiết RNA trong một bước sao chép ngược RNA virus vào cDNA và sau đó khuếch đại PCR trong một phản ứng ống xuất hiện dưới dạng phát hiện cụ thể của HRV (Hình 1). Khả năng phát hiện HRV trong các mẫu dịch tiết mũi họng đã tăng lên nhiều lần khi sử dụng xét nghiệm RT-PCR được kiểm chứng.
Trong nghiên cứu này, đã phát hiện thường xuyên virus rhovirus ở người bằng RT-PCR, những kết quả này phù hợp với Xiang ZD [15] đã giải thích rằng hệ thống RT-PCR một bước rất đặc hiệu, nhanh chóng và thuận tiện để phát hiện RNA HRV trong dịch tiết mũi họng của bệnh nhân bị nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính và bộ gen của virus HRV rất khác nhau. Tuy nhiên, các quy trình chẩn đoán tê giác ở người sử dụng nuôi cấy mô bị giới hạn bởi chuyên môn của phòng thí nghiệm chẩn đoán và thời gian cần thiết để đạt được kết quả như vậy, nuôi cấy virus có một vị trí hạn chế trong vi sinh chẩn đoán thông thường [16].
Human rhinovirus (HRV)
Là nguyên nhân chính gây ra các triệu chứng cảm lạnh thông thường ở người lớn và trẻ em, bệnh nhân trưởng thành cũng thường xuyên bị nhiễm trùng đường hô hấp trên do nhiễm Human rhinovirus [17]. Hơn một trăm loại huyết thanh của loài tê giác người (HRV), là thành viên của họ Picornaviridae, được xác định thông qua giám sát cộng đồng về bệnh cảm lạnh thông thường về hô hấp [18]. Human rhinovirus (HRV) là mầm bệnh đường hô hấp phổ biến nhất, gây ra không chỉ nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính và viêm phổi mắc phải ở cộng đồng ở trẻ em, mà còn gây ra bệnh hen suyễn và suy thoái [15].
Sự vắng mặt của phương pháp phát hiện làm hạn chế sự hiểu biết lâm sàng về khả năng gây bệnh của HRV và gây ra việc sử dụng kháng sinh không hợp lý bằng các xét nghiệm huyết thanh học. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm xây dựng một hệ thống PCR sao chép ngược (RT) một bước để phát hiện cụ thể RNA của Human rhinovirus. Do đó, chúng tôi kết luận rằng hệ thống RT-PCR một bước có thể được coi là đặc hiệu cao, nhanh chóng và thuận tiện để phát hiện HRV trong dịch tiết mũi họng của bệnh nhân bị nhiễm trùng đường hô hấp trên và phương pháp chẩn đoán phân tử có thể phù hợp với quy mô lớn nghiên cứu lâm sàng và dịch tễ học.
Tác giả: Kassim Raisan Dekhil,Anwar Salih Saihood,Hassan Hachim Naser
>>> Tham khảo thêm ở bản gốc: Phát hiện virus mũi (HRV) ở đường hô hấp trên
